L'absence de Godot éveille chez eux doutes et questionnements. Deux autres personnages font leur apparition: Pozzo, autoritaire, et son esclave Lucky. A la suite du monologue absurde de ce dernier, Vladimir et Estragon se retrouvent à nouveau seuls.

Le premier acte se clôt sur l'arrivée d'un enfant qui les informe que Godot ne viendra que le lendemain.