Née le 29 août 1981 en Belgique, Emilie Dequenne grandit à la campagne, à côté de Mons, dans la province du Hainaut. Ses parents travaillent dans l'entreprise familiale de menuiserie fondée par son grand-père. Elle passe ses journées avec sa soeur et ses cousins. Au programme : déguisements et petits spectacles, car la petite fille aime déjà mettre en scène des histoires.

L'adolescente, bonne élève, suit parallèlement à sa scolarité des cours dans un atelier de théâtre et poursuit son rêve de jouer la comédie. Elle remporte le Prix de la ville de Mons au Tournoi d'éloquence au Club Richelieu de Mons-Borinage en 1998. A 16 ans, encouragée par sa tante, elle passe le casting des réalisateurs belges Luc et Jean-Pierre Dardenne pour leur long-métrage Rosetta. Immédiatement séduits par son côté entière et nature, les cinéastes la choisissent parmi les trois cents filles présentes aux essais. Ce premier rôle la révèle au grand public et lui vaut le prix d'interprétation féminine au festival de Cannes en 1999.

En 2001, Christophe Gans lui confie un rôle dans la superproduction Le Pacte des Loups aux côtés de Vincent Cassel et Samuel Le Bihan. Sa carrière prend un nouvel essor, la jeune femme décide alors de s'installer à Paris. Ce deuxième rôle la consacre à nouveau, elle reçoit le Swann d'or de la révélation féminine au Festival de Cabourg.

Actrice caméléon, comme le tatouage qu'elle porte à l'épaule, Emilie Dequenne varie les registres et passe de la comédie (Une femme de ménage, Mariées mais pas trop) au drame (Le Grand Meaulnes, La fille du RER, A perdre la raison) en passant par le film d'époque (Le Pont du roi Saint-Louis, Au-revoir là-haut) et le film de genre (La Meute, Möbius). Elle s'est aussi distinguée sur les planches avec la pièce Mademoiselle Julie en 2006 et dans Alexandra David-Neel/Mon Tibet de Didier Long en 2009. Elle reçoit au Festival de Cannes en 2012 le Prix d'interprétation féminine Un certain Regard pour son rôle de Murielle dans A perdre la raison de Joachim Lafosse, qui lui vaudra aussi le Magritte de la meilleure actrice. Elle recevra à nouveau le Magritte de la meilleure actrice en 2015 pour Pas son genre de Lucas Belvaux et en 2017 pour Chez Nous de Lucas Belvaux. Elle a aussi interprété de nombreux rôles à la télévision (avec Yves Boisset, Henri Helman, Marion Vernoux, Stéphane Kappes, Yann Samuel, Vincent Lannoo, Eléonore Faucher entre autres). Sa filmographie est déjà riche de plus de 40 rôles.